基因组尺度启动子识别及序列-转录强度数据库的建立

由于深度神经网络的训练需要庞大的数据集，实验和文献的数据量不足以支持神经网络的训练。为解决这一问题，首先，在NCBI数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/665?genome_assembly_id=300274) 中找到野生型枯草芽孢杆菌Bacullus subtilis 168中的所有基因，共4536个，并通过爬虫获取其所有基因的上游200bp基因序列。然后通过预测的方法产生基因上游200bp中最有可能是启动子的序列。选取表1报道的软件分别进行预测分析。

表1 启动子预测工具

预测工具	网址
iProEP	http://lin-group.cn/server/iProEP/pages/predictor.php
Bacpp	http://bacpp.bioinfoucs.com/ferramenta
Sph	https://sapphire.biw.kuleuven.be/index.php
BDPG	https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
Ipro70	http://ipro70.pythonanywhere.com/server

其中，对于iProEP，可以选择物种，在这里选择枯草芽孢杆菌。Bacpp中有sigma24，sigma28等多个因子作为选项，Sph中有run SAPPHIRE_1，SAPPHIRE_2_pseudomonas，SAPPHIRE_2_salmonella三个选项。

选择60个已知启动子序列使用上述工具预测，统计多款工具对这些序列的预测结果，计算预测结果与真实启动子位置差值的最大值、最小值、方差和平均值到如下可视化结果。

从以上两图中，我们不难得到如下结果：

• 最大误差(越小越好) sph2s < ipro70 < bacppS38 < bacppS24 < else
• 最小误差(越小越好) sph2s = sph2p = ipro70 = sph1 = else
• 方差（越小越好） sph2s < sph2p < ipro70 < sph1 < else
• 平均值(越小越好) sph2s < sph2p < ipro70 < sph1 < else
• 误差总和（越小越好） sph2s < sph2p < ipro70 < sph1 < else

最终比对多个软件的预测结果，其中 SAPPHIRE 2 for salmonela （沙门氏菌数据训练的人工神经网络）、SAPPHIRE 2 for Pseudomonas （假单胞菌数据训练的人工神经网络）、ipro70 (使用多窗口和最小特征识别Sigma70启动子)的预测效果较好。

在此基础上用这三个工具预测的启动子位置投票出最终结果，投票流程如下：

潜在问题：

1. 一个基因对应不只一个启动子（串联启动子的情况，中间会隔几十bp不会有重叠）。
2. 一个基因前面可能没有启动子（操纵子的情况）。

应对方式：

1. 忽略这种情况，只取一个打分最高的启动子。
2. 如果所有预测都打分较低则放弃这个基因。

通过以上步骤，最终得到约4500个枯草芽孢杆菌的预测启动子序列，结合转录组测序的结果，建立了 启动子序列-转录强度数据库，作为后续模型训练的数据集。

文献数据收集

枯草芽孢杆菌作为重要的原核模式微生物，近年来，研究者们也通过天然启动子之间的串联及融合，或者是对天然启动子的核心元件进行突变等策略构建了一系列枯草芽孢杆菌的人工启动子，用于枯草芽孢杆菌基因的表达调控。

通过查阅文献，我们全面搜集了此前已在枯草芽孢杆菌中构建合成启动子文库的相关数据^[1-9]。相关文献中的启动子强度多以实验中的绿色荧光蛋白表达强度的相关强度表征，但由于文献中数据信息类型多样且存在缺少，需要进一步的补充与处理。根据我们收集到的数据的不同类型，分别采取以下策略进行完善：

• 类型一：文章中有短序列信息且注明起始位点：
  处理方式：利用blast检索短序列，补充上游序列至长度为61bp；
• 类型二：文章中没有相对活性值，但提供柱状图：
  处理方式：利用Getdata软件取点读近似值，获得启动子强度信息；
• 类型三：文章中有启动子序列，但未标明转录起始位点：
  处理方式：利用Softberry工具预测转录启动子转录起始位点，序列不足61bp 的利用Blast检索补足。

文献启动子表征

经过上述的文献调研与整理，我们搜集得到了9篇文献12组共约600条启动子的序列与其荧光表达强度的数据，且均是以测量枯草芽孢杆菌中GFP荧光表达强度为表征手段。但由于不同实验室在培养微生物和测量荧光强度的实验设备、操作流程上存在差异，所以不同文献中的荧光值并不能直接使用。Jason等^[10]研究发现，虽然荧光表达强度不能直接通用，但各启动子的相对表达强度是较稳定的。基于这一点，我们从每组数据中各选取一条启动子，以及枯草芽孢杆菌中常用启动子P_vegI作为内标，共13条启动子在本地进行表征，从而获得13条启动子的相对强度关系，并根据每条启动子在其来源文库的数据将相对强度关系扩展，从而获得所有启动子的相对强度关系，构建序列-荧光强度数据库，具体实验流程如下：

一、含GFP空白质粒的构建

以Pad-123质粒为模板，以Pad-F和Pad-R为引物反向扩增得到线性化载体Pad-123。以Pbad-GFP质粒为模板，以G-F和G-R为引物扩增得到携带核糖体结合位点（RBS）序列的GFP片段，核糖体结合位点序列为“AAGAAGGAGATATACAT”。将PCR扩增得到的GFP片段与线性化载体Pad-123进行连接，获得重组质粒Pad-123-GFP。

二、各启动子报告质粒的构建

均以Pad-123-gfp质粒为模板，用经设计的不同引物进行PCR。各引物上设计有对应的启动子序列，且上引和下引含有25bp的同源区，以供再次连接成环形质粒。

1. 经PCR和酶消化后，得到含有不同启动子与GFP的线性化载体片段，之后进行消化、胶收。


图9 各报告质粒构建过程示意图（扩增得到线性片段）（类型三）

2. 胶回收经消化的产物后，将其采用化学转化法转化进入感受态大肠杆菌DH5α，进行同源重组，以将线性化载体重新连接为环形质粒，同时利用大肠杆菌进行质粒的扩增。


图10 各报告质粒构建过程示意图（线性片段同源重组）

3. 转化的感受态大肠杆菌涂布于LB固体平板上，筛选白色菌落，转接提取质粒，条带显示为阳性克隆送测序验证，即可得13个含不同启动子的报告质粒。

实验中选用的启动子编号及其序列如下：

表2 选用启动子编号及其序列

1	GTGTTTAAAATTAAAGTTTAAGATGTTGGATTTTTTAAATAAAGCGTTTACAATATATGTA
2	GTGTTTAAAATTAAAGTTTAAATATTTGGATTTTTTAAATAGCTGGGTTACAATATATGTA
3	GCATGAAACTTTTCACCCATTTTTCGGTGATAAAAACATTTTCTTTTGATAAACTGAACGG
4	GTGTTTAAAATTAAAGTTTAAAGCGGGTGATTTTTTAAATAAAGCGTTTACAATATATGTA
5	AACGTTGATACCGGTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTCTAATAAATGTG
6	GCCTGCAAACGTTAAGATGGCAAGCTTGACAAGTATTTCCGACACATTTAGAATGAAGTTG
7	TTTATCCTTTACTGCGTCAATACACGTTGACACTCTTTTGATTTACTGTTAAATTATCAGG
8	GTGCTTAAAATTAAAGTTTAAATATTTGACATTTTTAAATAAAGCGTTTATAATATATGTA
9	ACGACATTTCATATTTCTTCTAATGCAGAAGATATGATAGAATAGAACTCGAACCGTATAT
10	GTTGGGCAGCCATCCTTGTTGGATTACTATGTATTTCGGCTCAATATTATTATGGTTAAAG
11	TTATCCTAACAGATCCATTGTTCATTGTAAATAATGGAATACGAGTTTTATATTATAAAAG
12	AAGGCAGGCAAATGCGAAAAAGGTGTTGACAACAGTGAATGCTTATGGTATAATTAGTGAA
Pvegi	TTTACCGAAACTTGCGGAACATAATTGAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATT GACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTT GTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCA

三、报告菌株的构建

将各报告质粒及空白质粒（表征时作为参比）采用spizizen转化法转化进入B. subtilis168菌株，转化的枯草芽孢杆菌涂布于LB固体平板上，筛选白色菌落，条带显示为阳性克隆，即得13个含不同启动子的报告菌株。

Spizizen转化法详细流程如下：

1. 使用接种环挑一个单菌落到不带相应抗性的5 ml GM1培养基的试管中，220 r/min、37 ℃过夜培养。
2. 使用移液枪吸取500 μL菌液加到GM1培养基中（保证总体积5 mL不变，后同），220 r/min、37 ℃培养至对数生长期中后期(4.5 h)。
3. 使用移液枪吸取1.5 mL菌液加入至现配好的GM2培养基中，220 r/min、37 ℃培养90 min。
4. 使用移液枪吸取200 μL菌液置于无菌EP管中，加入适量质粒，置于37℃恒温培养箱培养1 h。
5. 将EP管置于220 r/min、37 ℃培养1 h。
6. 将菌液涂布于带有相应抗性的筛选平板中，37 ℃静置培养。

四、荧光表达强度的表征

将构建好的报告菌株进行发酵培养，在合适的时间测量其OD₆₀₀和荧光强度，并以P_vegi为内标，以不含启动子的空白质粒为参比，进行一致化处理，详细流程如下

1. 挑取平板活化的单克隆接入5 mL LB培养基中，37 ℃、220 r/min条件下过夜培养。
2. 取适量培养物转接入含25 mL LB培养基的150 mL摇瓶中，使得初始OD₆₀₀为0.5，在同样的条件下培养。每个样品3个平行。
3. 首先测定细胞的OD₆₀₀（4-6），4000rpm离心2 min，弃上清，等量双蒸馏水重悬细胞，重复离心重悬一次，彻底洗去培养基。
4. 将200 μL样品转移到酶标板上，在485 nm激发后，在533 nm处测量gfp荧光。 关于所得数据的处理与结果，我们将在结果中作详细讨论，您可 点击此处进行浏览。